Dopo aver subito un attentato il 15 luglio 1500 in cui aveva riportato parecchie ferite era convalescente nelle proprie stanze in Vaticano quando il 18 agosto fu aggredito da un manipolo di uomini armati e strangolato nel letto da Michelotto Coreglia, il sicario di Cesare Borgia. Alla moglie Lucrezia e alla sorella Sancia fu impedito di vedere il cadavere e di partecipare agli affrettati funerali. Mentre Cesare Borgia sostenne che Alfonso stesse cospirando contro di lui è probabile che la ragione vera dell’attentato sia stata la volontà di liberare Lucrezia dal marito al fine di combinare per lei delle nuove nozze vantaggiose, cosa che poi avvenne due anni dopo quando sposò il duca di Ferrara.